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Né, à Saint-Martin-du-Fresne, dans le Bugey, Castellion étudie à Lyon où il fréquente les humanistes et s'essaie à la poésie. La lecture de l'Institution chrétienne de Calvin et la persécution des protestants dont il est le spectateur indigné le poussent à partir pour Strasbourg en 1540. Il y rencontre Calvin qu'il rejoint en 1542 à Genève où il devient le principal du collège.
Il publie en 1543 les Dialogues sacrés dans lesquels il témoigne de sa haine des tyrans et des persécuteurs. "Il n'y a rien, écrit-il, qui résiste plus obstinément à la vérité que les grands de ce monde". Castellion supporte mal l'autorité de plus en plus absolue de Calvin à Genève. Mettant en garde contre l'absolutisme du nouveau tyran, il démissionne du collège et est mis en demeure de quitter la ville. Il commence à traduire la Bible et connaît plusieurs années de misère jusqu'en 1553 où il devient maître ès arts puis lecteur de grec à l'université de Bâle.
Le 27 octobre 1553, Calvin fait exécuter Michel Servet. Peu après paraît à Bâle une brochure intitulée De haereticis an sint persequendi signée Martin Bellie, alias Castellion (1554). On y trouve des extraits de Luther, de Sébastien Franck, d'Érasme et de Castellion. C'est un plaidoyer pour la liberté de conscience et la tolérance. L'auteur y souhaite "qu'un chacun retourne à soi-même, et soit soigneux de corriger sa vie, et non de condamner les autres".
La réaction contre Sébastien Castellion mobilise Bèze, qui dénonce sa "charité diabolique et non chrétienne", tandis que Calvin voit en lui: "un monstre qui a autant de venin qu'il a d'audace". À Bâle aussi, Castellion est attaqué de toutes parts pour avoir pris parti contre la prédestination et surtout pour son attachement à la liberté.
En 1562, dans Conseil à la France désolée il lance à Calvin à propos de l'éxécution de Servet: "Tuer un homme, ce n'est pas défendre une doctrine, c'est tuer un homme". Cet écrit, qui est un appel pathétique à la tolérance et une exhortation à mettre fin aux luttes religieuses et aux persécutions, soulève une réprobation unanime et entraîne des poursuites contre des membres de sa famille qui l'ont fait circuler à Genève.
Sébastien Castellion meurt le 29 décembre 1563. Il est demeuré largement méconnu.